Kalite Kontrol Quality Control

NGS verilerini analiz etmeden önce ham okumaların kalitesini değerlendirmek ve düşük kaliteli bölgeleri temizlemek kritik öneme sahiptir. Bu adımı atlamak, downstream analizlerde (assembly, varyant tespiti, anotasyon) hatalı sonuçlara yol açar.

---

FastQC ile Kalite Değerlendirmesi

FastQC, NGS verilerinin kalitesini görsel olarak değerlendiren en yaygın kullanılan araçtır. HTML formatında kapsamlı bir rapor üretir.

Kurulum ve Çalıştırma

# Conda ile kurulum
conda install -c bioconda fastqc

# Tek dosya analizi
fastqc ornek_R1.fastq.gz

# Çoklu dosya analizi
fastqc *.fastq.gz -o qc_sonuclari/ -t 8

FastQC Raporu — Temel Modüller

• Per base sequence quality: Her pozisyondaki Phred kalite skorlarının kutu grafikleri. Q30 çizgisinin altındaki pozisyonlar sorunlu kabul edilir.
• Per sequence quality scores: Tüm okumaların ortalama kalite dağılımı.
• Per base sequence content: Her pozisyonda A/T/G/C oranları. İlk 10-15 bazda dengesizlik normaldir (primer bölgesi).
• Per sequence GC content: Okumaların GC içeriği dağılımı. Çan eğrisinden sapma kontaminasyona işaret edebilir.
• Sequence length distribution: Okuma uzunluğu dağılımı.
• Sequence duplication levels: Tekrarlayan okuma oranları. Yüksek duplikasyon PCR artefaktını gösterebilir.
• Overrepresented sequences: Sık tekrarlayan diziler (adaptör kirlilik göstergesi olabilir).
• Adapter Content: Adaptör dizilerinin varlığı ve konumu.

---

MultiQC — Toplu Rapor

Birden fazla örneğin FastQC raporlarını tek bir HTML dosyasında birleştirir. Büyük projelerde vazgeçilmezdir.

conda install -c bioconda multiqc
multiqc qc_sonuclari/

---

Trimmomatic ile Adaptör Temizleme ve Kırpma

Trimmomatic, Illumina verilerinde adaptör dizilerini ve düşük kaliteli bölgeleri kaldırmak için kullanılır.

Temel Kullanım (Paired-End)

trimmomatic PE \
    ornek_R1.fastq.gz ornek_R2.fastq.gz \
    ornek_R1_temiz.fastq.gz ornek_R1_tek.fastq.gz \
    ornek_R2_temiz.fastq.gz ornek_R2_tek.fastq.gz \
    ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
    LEADING:3 \
    TRAILING:3 \
    SLIDINGWINDOW:4:20 \
    MINLEN:36

Parametreler

• ILLUMINACLIP: Adaptör dizisi dosyası ve eşleşme parametreleri
• LEADING:3 — Baştan kalite <3 olan bazları kes
• TRAILING:3 — Sondan kalite <3 olan bazları kes
• SLIDINGWINDOW:4:20 — 4 bazlık pencerede ortalama kalite <20 ise kes
• MINLEN:36 — 36 bp'den kısa okumaları at

---

Fastp — Hızlı QC ve Temizleme

Fastp, hem kalite değerlendirmesi hem de temizlemeyi tek adımda yapan modern ve hızlı bir araçtır.

conda install -c bioconda fastp

# Paired-end işleme
fastp \
    -i R1.fastq.gz -I R2.fastq.gz \
    -o R1_temiz.fastq.gz -O R2_temiz.fastq.gz \
    --html fastp_raporu.html \
    --json fastp_raporu.json \
    --thread 8 \
    --qualified_quality_phred 20 \
    --length_required 50

---

Kalite Kontrol İş Akışı

1. Ham veriler üzerinde FastQC çalıştır → raporu incele
2. Sorun varsa Trimmomatic veya Fastp ile temizle
3. Temizlenmiş veriler üzerinde tekrar FastQC çalıştır
4. MultiQC ile tüm örneklerin özetini çıkar
5. Geçen örnekleri downstream analizlere gönder

---

Uzun Okumalar için QC (Nanopore/PacBio)

Nanopore ve PacBio verileri için farklı araçlar kullanılır:

• NanoPlot: Oxford Nanopore verilerinin kalite görselleştirmesi
• NanoFilt: Nanopore okumalarının filtrelenmesi ve kırpılması
• LongQC: Uzun okuma verileri için genel QC aracı

# Nanopore QC
conda install -c bioconda nanoplot nanofilt

NanoPlot --fastq okumaları.fastq.gz --outdir nanoplot_sonuc/

# Filtreleme: minimum Q8, minimum 1000 bp
NanoFilt -q 8 -l 1000 okumaları.fastq.gz > temiz_okumaları.fastq

# Install via Conda
conda install -c bioconda fastqc

# Single file analysis
fastqc sample_R1.fastq.gz

# Multiple file analysis
fastqc *.fastq.gz -o qc_results/ -t 8

conda install -c bioconda multiqc
multiqc qc_results/

trimmomatic PE \
    sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz \
    sample_R1_clean.fastq.gz sample_R1_unpaired.fastq.gz \
    sample_R2_clean.fastq.gz sample_R2_unpaired.fastq.gz \
    ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
    LEADING:3 \
    TRAILING:3 \
    SLIDINGWINDOW:4:20 \
    MINLEN:36

conda install -c bioconda fastp

# Paired-end processing
fastp \
    -i R1.fastq.gz -I R2.fastq.gz \
    -o R1_clean.fastq.gz -O R2_clean.fastq.gz \
    --html fastp_report.html \
    --json fastp_report.json \
    --thread 8 \
    --qualified_quality_phred 20 \
    --length_required 50

# Nanopore QC
conda install -c bioconda nanoplot nanofilt

NanoPlot --fastq reads.fastq.gz --outdir nanoplot_output/

# Filter: minimum Q8, minimum 1000 bp
NanoFilt -q 8 -l 1000 reads.fastq.gz > clean_reads.fastq